Биология клетки/Часть 1. Клетка как она есть/3/3

← Предыдущая глава	Глава 3.3	Следующая глава →
Удвоение ДНК

---

Удвоение ДНК — матричный синтез

Матричный биосинтез — запрограммированный с помощью нуклеиновых кислот (НК) процесс сборки новых цепей полимеров (нуклеиновые кислоты, используемые как программы в матричном биосинтезе, называют матрицами). Реакции матричного биосинтеза:

• реакция синтеза РНК на ДНК
• удвоение ДНК
• синтез белка на матрице иРНК

Значение реакции матричного синтеза:

• способность к воспроизведению себе подобных

Репликация ДНК — это процесс синтеза дочерней молекулы ДНК. Он происходит в процессе деления клетки на матрице родительской молекулы ДНК. Генетический материал, заключенный в ДНК, удваивается и делится между дочерними клетками. Репликацию ДНК осуществляет специальный фермент — ДНК-полимераза. Цепи ДНК расходятся, и каждая из них становится матрицей. Каждая синтезированная молекула ДНК состоит из одной цепи родительской молекулы и одной вновь синтезированной цепи. Такой механизм удвоения называется полуконсервативным.

Удвоение ДНК — полуконсервативная репликация

Уотсон и Крик предположили, что удвоение ДНК происходит по полуконсервативному механизму. Это означает, что каждой новой двойной спирали одна цепь нуклеотидов достаётся от старой, а вторая цепь достраивается заново. В 1958 г этот механизм был подтвержден в опыте Месельсона и Сталя.

Распределение ДНК в последовательных поколениях после переноса на среду с легким изотопом азота

Каждая молекула ДНК содержит множество атомов азота. Наиболее распространён изотоп азота ¹⁴N. Существует также изотоп ¹⁵N, он не радиоактивен, а лишь тяжелее ¹⁴N. Содержащие тяжелый изотоп молекулы ДНК функциональны и могут удваиваться.

Были выращены несколько поколений E. coli в среде, где в качестве источника азота присутствовали соли аммония, содержащие тяжелый изотоп ¹⁵N. Затем их ДНК была выделена и центрифугирована в градиенте плотность CsCl. Каждая молекула ДНК останавливалась на том уровне в пробирке, где её плотность совпадает с плотностью раствора соли. При длительном центрифугировании с ускорением около 10.000 g ионы цезия и хлора распределяются в пробирке неравномерно — у дна их концентрация повышается.

ДНК бактерий, выращенных в ¹⁵N среде, была более тяжёлой. Эти бактерии затем были помещены обратно в ¹⁴N среду, где им было позволено разделится только один раз. Затем из клеток были извлечена ДНК, её плавучая плотность оказалась больше плавучей плотности ДНК бактерий, выращенных в среде, богатой ¹⁴N, но меньше плавучей плотности ДНК бактерий, выращенных в ¹⁵N среде. Это противоречило гипотезе о консервативном характере репликации ДНК, когда одна дочерняя клетка получает материнскую ДНК, а вторая — вновь синтезированную, обе цепи которой — новые, так как в этом случае ДНК разделилась бы на две фракции — лёгкую, содержащую атомы ¹⁴N, и тяжёлую, содержащую ¹⁵N.

Однако этот результат не исключал дисперсный механизм репликации, когда куски материнской ДНК распределяются между дочерними ДНК случайным образом. Поэтому было выращено второе поколение бактерий, и их ДНК также была отцентрифугирована в градиенте хлористого цезия. Выяснилось, что клетки содержат в равном количестве как полностью «лёгкие» ДНК, так и «гибридные». Этот факт позволил исключить гипотезу дисперсного механизма репликации.

Задание 1

Для проведения этого эксперимента потребовалось получить синхронизированную культуру бактерий — такую культуру, в которой все клетки делятся одновременно. Как вы думаете, зачем?

Задание 2

Придумайте способы, с помощью которых можно получить такую культуру. Затем найдите в литературе данные о том, как в действительности получают синхронизированные культуры.

Задание 3

Предскажите результаты, которые получили бы Месельсон и Сталь в случае а) консервативного и б) дисперсного механизмов удвоения ДНК, Нарисуйте, как выглядело бы распределение ДНК в градиенте хлористого цезия через одно, два и три деления после переноса в среду с легким изотопом азота в случаях а) и б).

• [1] Анимация «Полуконсервативная репликация ДНК — опыт Месельсона и Сталя» (англ. текст)

Источником энергии для удвоения ДНК служат макроэргические связи трифосфатнуклеотидов

Структура АТФ

Молекулы трифосфатнуклеотидов (АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ) состоят из азотистого основания, сахара дезоксирибозы и трёх остатков ортофосфорной кислоты.

Трифосфатнуклеотиды относятся к макроэргическим соединениям, то есть к химическим соединениям, содержащим связи, при гидролизе которых высвобождается значительное количество энергии. В данном случае запасающие энергию связи — связи между остатками фосфорной кислоты. Гидролиз такой связи, сопровождаемый отщеплением двух остатков, приводит к выделению от 40 до 60 кДж/моль (в зависимости от условий).

При синтезе новой цепочки ДНК из трифосфатнуклеотидов от каждого из них отщепляется два остатка фосфорной кислоты. Выделяющейся при этом энергии хватает на образование ковалентной связи между неотщепившимся остатком фосфорной кислоты и третьим атомом углерода в дезоксирибозе следующего нуклеотида.

Фермент, катализирующий синтез ДНК — ДНК-зависимая ДНК-полимераза

ДНК-зависимые ДНК-полимеразы — это ферменты, осуществляющий репликацию ДНК (удвоение молекул ДНК). ДНК-полимеразы считывают информацию с цепи ДНК и достраивают вторую цепочку нуклеотидов, комплементарных данной, присоединяя к строящейся цепи нуклеотид, комплементарный нуклеотиду матричной цепи. Продукты этой реакции — удлиненная цепь ДНК и пирофосфат. Работа ДНК-полимеразы имеет свои особенности:

1. ДНК-полимераза может двигаться только в одну сторону — от 5' к 3'-концу, вследствие чего образуются лидирующая и отстающая цепи.
2. ДНК-полимеразе требуется затравка в виде короткого фрагмента РНК (она не может начать синтез цепи нуклеотидов «с нуля», а способна только добавлять нуклеотиды к цепи). Затравку создает фермент праймаза.
3. ДНК-полимераза может двигаться только по цепи раскрученной спирали ДНК. Цепи ДНК раскручивает белок геликаза.

В клетке может присутствовать до 4-5 разных типов ДНК-полимераз. У разных групп эукариот и прокариот встречаются альфа-, бета-, дельта-, гамма-, эпсилон-, дзета-, эта- ДНК-полимеразы. Различные ДНК-полимеразы могут выполнять разные функции. У эукариот непосредственно в репликации ДНК участвуют альфа-, дельта- и эпсилон- ДНК-полимеразы. Каждый тип репликационных ДНК-полимераз имеет свою вероятность ошибки при репликации. У эукариот вероятность вставки некомплементарного азотистого основания ДНК-полимеразой альфа равна 1/10⁶, а ДНК-полимеразой эпсилон равна 1/10⁷. Пострепликационные системы репарации снижают вероятность ошибок репликации ещё на порядок.

Одна из самых важных вторичных функций ДНК-полимераз — эксцизионная репарация ДНК (замена некомплементарного основания на комплементарное). Присоединив очередной нуклеотид, ДНК-полимераза как бы «оборачивается назад» и проверяет, образовал ли он правильные водородные связи с нуклеотидом матричной цепи. Если нет — нуклеотид удаляется. За счет этого вероятность вставки некомплементарного нуклеотида снижается до 1/10⁷−1/10⁸.

Например, бета ДНК-полимераза может удалять основание с помощью специфической N-гликозилазы, а ресинтез азотистого основания может производить только в мононуклеотидных брешах [2]; ДНК-полимеразы дельта и эпсилон, вероятно, не могут производить удаление основания, но зато могут производить ресинтез на более протяженных участках. Однако не все типы ДНК-полимераз способны к репарации. ДНК-полимеразы интенсивно исследуются учеными; возможно, будут открыты их новые функции.

В удвоении ДНК участвуют и другие ферменты

Схематическое изображение процесса репликации, цифрами отмечены: (1) запаздывающая нить, (2) лидирующая нить, (3) ДНК полимераза (Polα), (4) ДНК лигаза, (5) РНК праймер, (6) ДНК праймаза, (7) фрагмент Оказаки, (8) ДНК полимераза (Polδ), (9) хеликаза, (10) одиночная нить со связанными белками, (11) топоизомераза

Реплика́ция ДНК — это процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты, который происходит в процессе деления клетки на матрице родительской молекулы ДНК. Репликацию ДНК осуществляет фермент ДНК-полимераза (репликация у эукариот осуществляется несколькими разными ДНК-полимеразами).

ДНК-полимераза — фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона.

Кроме ДНК-полимераз в процессе редупликации участвуют другие ферменты:

1) Хеликазы перемещаются по сахаро-фосфатному остову нуклеиновых кислот и разрывают водородные связи между комплементарно соединенными основаниями (rep-белок).

2) ДНК-праймаза синтезирует короткий фрагмент РНК, называемый праймером, комплементарный одноцепочечной матрице ДНК.

3) ДНК-лигаза сшивает фрагменты ДНК «отстающей» цепи, образующиеся при репликации.

4) Топоизомераза оборачивается вокруг ДНК и вносит разрыв, который позволяет спирали ДНК вращаться и снимает напряжение. После релаксации, топоизомераза соединяет разорванные концы.

5) ДНК-связывающие белки, которые расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии, тем самым не давая восстановиться водородным связям, и вращают молекулу ДНК.

Геликазы расплетают двойную спираль

Структура геликазы RuvA бактерии Escherichia coli

Геликазы (от англ. helix — спираль) — ферменты, раскручивающие двойную спираль ДНК с затратой энергии АТФ и ГТФ. ДНК-геликазы — лишь одна из групп геликаз, есть еще РНК-геликазы. ДНК-геликазы участвуют в репликации, транскрипции,репарации и рекомбинации. Геликазы могут быть активны в качестве мономера или димера, хотя, например, геликазы DnaB активны в качестве гексамера (комплекса из шести субъединиц), образующего баранкообразную структуру. Для расплетания спирали нужен один геликазный белок, но для достижения большей скорости раскручивания несколько геликаз могут действовать совместно.

ДНК-геликазы рвут водордные связи между комплементарными нуклеотидами двух цепей, двигаясь при этом в противоположных направлениях (5'->3' или 3'->5'). При этом образуются две одноцепочечные молекулы, которые потом будут служить матрицей для достраивания второй цепи. Образуется структура Y-образной формы, названная репликационной вилкой. Но при таком быстром расплетании нитей, без вращения относительно друг друга, будут образовываться «узелки» — сверхскрученные участки, как на витой веревке, если её пытаться расплести не с конца, а с середины, растягивая. Суперскрученность устраняет специальный фермент ДНК-топоизомераза.

Схема репликационной вилки.
a:мРНК, b: лидирующая цепь, c: отстающая цепь, d: репликационная вилка, e: РНК праймер, f: фрагменты Оказаки

В клетке присутствует много разновидностей геликаз; так, у человека их 24. При нарушении их работы могут возникать болезни: пигментная ксеродерма, синдром Коккейна, синдром Блума, синдром Вернера.

По характеру и последствиям мутации можно объединить синдром Блума и синдром Вернера в одну группу, а синдром Коккейна и пигментную ксеродерму — в другую.

При синдроме Вернера происходят мутации в гене WRN, кодирующем ДНК-геликазу. Эта мутация вызывает нарушение процесса репарации и репликации, нестабильность генома, 10-кратное увеличение темпа мутаций и уменьшение потенциала делений клеток в культуре.

При синдроме Блума мутация происходит в гене BLM, принадлежащем к генам ДНК-геликаз. Синдром Блума также характеризуется нестабильностью генома и повышенным риском канцерогенеза.

При синдроме Коккейна, сходном с пигментной ксеродермой, основная причина заболевания — дефект одного из механизмов эксцизионной репарации нуклеотидов. При разных вариантах синдрома Коккейна причиной заболевания бывает нарушение функций нескольких генов (CSA,CSB,XPD,XPB,XPG), причём мутации в 3 последних генах бывают и при пигментной ксеродерме. Это заболевание вызвано тем, что после повреждений клеток кожи ультрафиолетовым облучением ДНК фибробластов не восстанавливается.

И при пигментной ксеродерме основная причина заболевания — дефекты раннего этапа эксцизионной репарации нуклеотидов. Мутации происходят в разных генах, кодирующих геликазы — от XPA до XPG. Однако основные причины пигментной ксеродермы — два вида нарушений генотипа: недостаток фермента УФ-эндонуклеазы, опознающего участки, поврежденные УФ-излучением, или дефект ДНК-полимеразы, участвующей в соединении разрывов ДНК (разрывы обычно появляются из-за повреждений кожи, вызванных УФ-облучением (как и при синдроме Коккейна)). Так что при синдроме Коккейна и пигментной ксеродерме мутации, связанные с ДНК-геликазами, не являются основными.

Топоизомеразы разрезают и сшивают нить ДНК, позволяя спирали раскручиваться

Топоизомеразы (topoisomerases) — класс ферментов-изомераз, которые влияют на топологию ДНК. Впервые топоизомеразы были описаны профессором Гарвардского университета Джеймсом Вангом.

Молекулярная масса топоизомераз колеблется в пределах от 60 тыс. до 140 тыс дальтон. После трансляции фермент подвержен модификациям, в частности, фосфорилированию. Минимальный размер олигонуклеотидов, расщепляемых топоизомеразами ≈ 7-8 нуклеотидных остатков.

В обычном состоянии ДНК пребывает в форме двойной спирали, и такая структура не позволяет отдельным цепочкам расходиться. Для расплавления двойной спирали (разрыва водородных связей между основаниями) используются специальные ферменты — хеликазы, которые позволяют осуществлять транскрипцию или репликацию другим белкам.

Классификация ферментов основана на механизме их действия на молекулу ДНК: к топоизомеразам I группы относятся ферменты, катализирующие изменения топологическое состояния молекулы с помощью однонитевого разрыва-зашивания двухнитевой молекулы ДНК, к топоизомеразам II группы — с помощью двухнитевого разрыва-зашивания. В некоторых случаях реакция АТФ-зависимая.

Установлено, что топоизомеразы I группы образуют в ходе реакции ковалентный промежуточный комплекс ДНК-белок. Фермент эукариот соединяется через тирозиновый остаток с 3'-концом разорванной цепи ДНК, у прокариот — с 5'-концом. После перемещении разорванных концов ДНК относительно друг друга обе формы топоизомераз восстанавливают ее целостность.

Встраивание вирусной ДНК в хромосомы хозяина и другие формы рекомбинации также требуют присутствие топоизомераз.

Активность топоизомеразы во многих случаях угнетается противоопухолевыми и противомикробными препаратами (например, налидиксовой и оксолиниевой кислотами).

[3] О. О. Фаворова. Сохранение ДНК в ряду поколений: репликация ДНК.

[4] Анимация: Удвоение ДНК (функции различных белков) (англ.)